2023, Vol. 42文章信息
- 韓玉, 張婧, 趙晰, 王耀光, 馬雷雷
- HAN Yu, ZHANG Jing, ZHAO Xi, WANG Yaoguang, MA Leilei
- 加味防己黃芪湯對UUO大鼠纖維化干預作用及對JAK2/STAT3信號通路影響
- Intervention effect of Jiawei Fangji Huangqi Decoction on fibrosis and JAK2/STAT3 signal pathway in UUO rats
- 天津中醫藥大學學報, 2023, 42(2): 197-205
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2023, 42(2): 197-205
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2023.02.13
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文章歷史
收稿日期: 2022-11-30
慢性腎臟?。–KD）是一種威脅生命的全球性健康問題，患病率逐年增加，且易合并并發癥嚴重影響患者生存質量。CKD的主要病理變化以進行性腎臟炎癥和腎間質纖維化（RIF）為特征，而腎間質纖維化的程度和病變速度，則是CKD進展為終末期腎病的關鍵因素。RIF發展過程中，伴隨持續的細胞死亡和炎性細胞浸潤，病變過程會促進細胞增殖，同時炎癥細胞產生的自由基還通過誘導上皮間質轉化（EMT）促進纖維化的發展[1-4]。因此，尋找能夠有效控制腎臟炎癥反應、減緩EMT發生發展的藥物具有重要的現實意義。近年來中醫藥在防治RIF方面具有著一定的優勢，中藥方劑多靶點的作用方式，能夠更好的兼顧抗炎及抗纖維的作用，本研究中的加味防己黃芪湯化裁于《金匱要略》，為王耀光教授治療CKD的核心處方，為明確其是否能夠對于RIF起到延緩作用進而發揮保護殘余腎功能的作用，本研究設計動物實驗利用大鼠單側輸愕管梗阻（UUO）模型進行驗證。
1 實驗材料及方法 1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠共60只，體質量（180±20）g，由易生源基因科技（天津）有限公司提供，許可證號SYXK（津）2021-0003。飼養于天津易生源動物房，實驗期間飲用水為清潔自來水、自由攝食，實驗室自然光照，室溫20~24 ℃左右，通風濕度良好，隔2日更換一次墊料，大鼠適應性喂養1周狀態良好后進行實驗。
1.2 藥物、試劑及儀器 1.2.1 藥物制備加味防己黃芪湯組成：生黃芪30 g，防己10 g，生白術10 g，地龍10 g，赤芍10 g，以上藥材由天津中醫藥大學第一附屬醫院提供，并對藥物進行煎煮濃縮。按照成人體質量70 kg，每日服用藥物生黃芪30 g，防己10 g，生白術10 g，地龍10 g，赤芍10 g，總計每日總生藥量70 g計算，參考《藥理實驗方法學》通過人與大鼠間體表面積法進行換算，按照大鼠平均體質量200 g，每日最大灌胃量2 mL，體表系數0.018計算，換算大鼠每日用藥等效劑量為70 g×0.018/2 mL=0.63 g/mL（即每日生藥量1.26 g），以等效劑量作為中藥灌胃中劑量0.63 g/mL，1/2等效劑量作為低劑量0.315 g/mL，2倍等效劑量作為高劑量1.26 g/mL，將每付藥液濃度濃縮至高劑量1.26 g/mL，4 ℃保存，灌胃依照不同劑量稀釋。纈沙坦片（浙江華海藥業，批號H20183126）成人有效劑量為80 mg/d，將纈沙坦片用蒸餾水溶解，每日現配現用，配制為0.72 mg/mL濃度溶液，4 ℃保存，灌胃時稀釋使用。
1.2.2 主要試劑及儀器1）主要試劑：Jak2兔多克隆抗體（品牌：武漢三鷹，貨號：17670-1-AP）、STAT3兔多克隆抗體（品牌：武漢三鷹，貨號：10253-2-AP）、GAPDH兔多克隆抗體（品牌：武漢三鷹，貨號：10494-1-AP）、α-SMA兔多克隆抗體（品牌：Affinity，貨號：AF1032）、E-CAD兔多克隆抗體（品牌：Affinity，貨號：AF0131）、磷酸化JAK2兔多克隆抗體（品牌：萬類生物，貨號：WL02997）、磷酸化STAT3兔多克隆抗體（品牌：萬類生物，貨號：WLP2412）、山羊抗兔IgG抗體（品牌：Affinity，貨號：S0001）。
2）主要儀器：伯樂小型電泳儀（美國BIO-RAD公司，164-5050）、多功能酶標儀（美國Thermo公司，Varioskan LUX）、冷凍高速離心機（美國Thermo Fisher公司，75002445）、梯度PCR儀（美國ABI ProFlex公司，4484073）、熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司，LightCycler 96）、凝膠成像儀（德國耶拿公司，ChemStudio）、正置光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司，OLYMPUS CK31）等。
1.3 實驗方法 1.3.1 大鼠UUO模型構建將60只大鼠依次編號，用隨機數字表法分為6組，假手術組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、纈沙坦組，每組10只。術前禁食不禁水12 h，予戊巴比妥鈉50 mg/kg劑量麻醉大鼠[5]，假手術組僅鈍性剝離左側輸尿管，不予結扎；其余各組大鼠分別結扎左側輸尿管近腎盂段及輸尿管遠端，術后3 d予劑量為8萬IU/鼠的青霉素腹腔注射防止感染。于術后第7天，采用隨機數字表法，每組抽取3只大鼠進行腎臟取材，以腎臟病理馬松染色法（Masson）結果，作為纖維化模型構造成功的評價標準[6-8]。
1.3.2 給藥方法各組大鼠于術后1 d開始灌胃，每次灌胃前稱重大鼠體質量按照1 mL/100 g計量進行灌胃，共灌胃14 d。假手術組予生理鹽水；中藥低劑量組予湯劑0.32 g/（mL·d）；中藥中劑量組予湯劑0.63 g/（mL·d）；中藥高劑量組予湯劑1.26 g/（mL·d）；纈沙坦組予等效纈沙坦水溶液0.72 mg/（mL·d）。
1.3.3 樣本收集方法于灌胃第13天時，禁食不禁水12 h，將60只大鼠分裝至代謝籠中，收集24 h尿液樣本。予戊巴比妥鈉50 mg/kg劑量麻醉大鼠后固定，腹主動脈采血，抗凝管收集，室溫靜置1 h，3 000 rpm離心15 min，離心半徑為144 mm；分離上層血清，-80 ℃冰箱保存。迅速切除左側腎臟，除去包膜、多余脂肪組織，排空腎內積水，生理鹽水沖洗稱質量，取部分腎組織置于4%多聚甲醛中固定；另一部分置于液氮，后放入-80 ℃保存。
1.4 檢測指標及方法 1.4.1 大鼠腎臟臟器系數、生化指標檢測稱質量各組大鼠左腎質量，并計算腎臟臟器系數，腎臟臟器系數=左側腎質量/大鼠體質量×100%。利用南京建成生化試劑盒檢測測各組大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量（24 h-UP）。
1.4.2 腎臟病理學檢測取4%多聚甲醛固定的腎臟標本，脫水、石蠟包埋4 μm切片，采用蘇木精-伊紅染色法（HE）以及Masson染色進行病理切片染色。在顯微鏡下觀測腎臟纖維化程度。
1.4.3 聚合酶鏈式反應（PCR）利用柱式法提取大鼠腎臟組織總RNA，利用分光光度儀測定RNA濃度。HiFiScript cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄，配置20 μL體系進行cDNA逆轉錄，使用UltraSYBR Mixturet進行擴增，設置20 μL反應體系PCR檢測。RT-PCR反應，反應體系：95 ℃預變形10 min，熱啟動40個循環（95 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延展1 min）。PCR通過計算基因的相對表達量（2-ΔΔCt）分析結果：以GAPDH為內參基因，計算方法為：ΔΔCt＝ΔCt實驗組（目的基因Ct值-內參基因Ct值）-ΔCt對照組（目的基因Ct值-內參基因Ct值）。引物由上海生工生物工程公司設計合成，引物序列見表 1。
稱取大鼠腎臟組織30 mg進行液氮研磨，RIPA裂解液裂解組織提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取10 μL蛋白樣品、4 μL彩色預染蛋白標準品在10%SDS-PAGE膠中上樣，設定100 V電壓進行電泳，溴酚藍至凝膠底部停止電泳。濕式電轉膜法轉移至PVDF膜上，400 mA恒定電流轉膜30 min?？焖俜忾]液室溫下封閉30 min。JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、E-cadherin、α-SMA以1∶1 000比例稀釋抗體，GAPDH以1∶5 000比例稀釋抗體，4 ℃孵育過夜。1xTBST洗膜3遍，Goat Anti-Rabbit IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，再次1xTBST洗膜3遍，特超敏ECL化學發光試劑盒顯影，凝膠成像儀檢測。GAPDH為內參蛋白，Image J軟件分析條帶，以目的蛋白與內參蛋白比值為相對表達量。
1.5 統計學方法利用SPSS 25.0統計分析軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，各組數據比較前先進行正態性及方差齊性檢驗。組間差異比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），符合正態分布且方差齊時采用SNK檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s檢驗；不符合正態分布時使用非參數檢驗。以P < 0.05為差異具有統計學意義。
2 結果 2.1 大鼠UUO模型構建結果術后第7天，Masson染色結果顯示，模型組及藥物干預組大鼠出現明顯的膠原沉積及腎小管擴張等間質纖維化表現，與假手術組相比差異顯著（P＜0.01），證實UUO模型構建成功，見圖 1。實驗過程中各組大鼠生命體征正常，未出現死亡病例，模型驗證成功后每組各有7只大鼠入組實驗觀察過程。
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| 注：與同時段模型組相比，**P<0.01；與同時段假后術組相比，##P<0.01。 圖 1 術后第7天各組大鼠Masson染色情況（bar=20 μm，×400） |
各組大鼠腎臟臟器系數比較，UUO模型構造14 d后，模型組明顯出現了腎臟臟器系數異常，模型組較假手術組比較腎臟臟器系數明顯升高（P＜0.01）；藥物干預組腎臟臟器系數較模型組明顯抑制（P＜0.05），見表 2。各組大鼠術后14 d出現了明顯的血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量的升高（P＜0.01），而藥物干預組較模型組明顯下降（P＜0.01），且中劑量、高劑量組整體改善較為明顯，見表 3、圖 2。
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| 注：A. 24 h-UP；B.血肌酐；C.尿素氮；與同時段模型組相比，**P<0.01；與同時段假手術組相比，##P<0.01。 圖 2 各組大鼠生化指標改善情況 |
HE染色結果顯示，假手術組腎臟組織結構清晰，腎小球大小適中，形態完整，毛細血管袢壁薄，分界清晰。內皮和系膜細胞數量正常，未見基質增生情況；腎小管結構正常，未見小管擴張、萎縮，小管細胞無空泡形成，無刷狀緣脫落；腎間質正常，未見明顯炎癥細胞浸潤。與同期假手術組相比模型組出現明顯的炎癥細胞浸潤、腎小球結構破壞、腎小管擴張刷狀緣脫落、間質增寬且伴隨炎癥浸潤，并伴有纖維化樣變，同時段的藥物干預組則較模型組有不同程度的改善，其中，西藥組、中劑量、高劑量改善情況較為明顯，見圖 3。
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| 圖 3 各組大鼠HE染色情況（bar=20 μm，×400） |
Masson染色結果顯示，假手術組的膠原纖維主要出現在基底膜和系膜區，而與假手術組比較，模型組大鼠可見大量藍色膠原纖維沉積，充斥于腎間質區域。治療組大鼠腎間質內的藍色膠原較模型組減少。模型組大鼠出現明顯的膠原沉積，與假手術組相比差異顯著（P＜0.01）。藥物干預組相比于模型組，膠原沉積均有不同程度的減輕，中劑量及高劑量組效果較為明顯（P＜0.01），見圖 4。
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| 注：與同時段模型組相比，**P<0.01；與同時段假后術組相比，##P<0.01。 圖 4 各組大鼠Masson染色情況（bar=20 μm，×400） |
同假手術組相比，模型組術后NF-κB、IκBa表達水平明顯上升（P＜0.01）。藥物干預組同模型組相比，NF-κB、IκBa表達水平明顯下降（P＜0.01）。其中NF-κB表達水平，藥物干預組同模型組相比表達水平均顯著下降（P＜0.01），西藥效果優于中藥干預組，（P＜0.05），中藥低、中、高劑量之間無顯著差異（P＞0.05）。IκBa表達水平，西藥組、中劑量、高劑量組較模型組表達水平顯著下降（P＜0.01），中藥低劑量組較模型組下降（P＜0.01），中藥低劑量組同其他藥物干預組之間相比無顯著差異（P＞0.05），見表 4。
檢測各組大鼠腎臟組織中RIF表型指標E-鈣黏蛋白（E-cad）、α-平滑肌肌動特異性蛋白（α-SMA）表達情況。結果顯示，E-cad蛋白表達情況，模型組同假手術組相比明顯上升（P＜0.01），中劑量組表達水平較模型明顯下降（P＜0.01）、高劑量組較模型下降（P＜0.05）、西藥組及低劑量組較模型組表達水平變化無統計學意義（P＞0.05），且中藥中劑量、高劑量表達水平變化同低劑量相比明顯下降（P＜0.05）。α-SMA蛋白表達模型組同假手術組相比明顯上升（P＜0.01），藥物干預組出現明顯下調，中劑量及高劑量組下降明顯（P＜0.01），且同西藥組及中藥低劑量組相比具有統計學意義（P＜0.05），見圖 5。
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| 注：與同時段假后術組相比，##P<0.01；與同時段模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。1.假手術組；2.模型組；3.西藥組；4.低劑量組；5.中劑量組；6.高劑量組。 圖 5 E-cad、α-SMA蛋白表達情況（x±s，n=3） |
Jak2/Stat3信號通路關鍵蛋白，p-Jak2、p-Stat3模型組同假手術組相比具有明顯的上升（P＜0.01）。p-Jak2蛋白表達，中藥低劑量、中劑量、高劑量組較模型組具有明顯的下調（P＜0.05），西藥組雖然具有下降趨勢但不具備統計學差異（P＞0.05）。p-Stat3蛋白表達中藥中劑量、高劑量同模型組相比具有明顯的下降（P＜0.01），而中藥低劑量及西藥組雖然能夠下調p-Stat3蛋白表達，但下降水平不具備統計學意義（P＞0.05），見圖 6。
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| 注：與同時段假后術組相比，##P<0.01；與同時段模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。1.假手術組；2.模型組；3.西藥組；4.低劑量組；5.中劑量組；6.高劑量組。 圖 6 p-Jak2、p-Stat3蛋白表達情況（x±s，n=3） |
RIF是實質內瘢痕的累積，它代表了幾乎所有慢性和進行性腎病的共同最終途徑[9-10]。EMT是RIF的核心機制，EMT賦予細胞轉移和入侵的能力，包括減少細胞凋亡與衰老、促進免疫抑制能力和一定的干細胞特征，對生長發育起著至關重要的作用。但在CKD慢性損傷過程中發生的EMT，常伴隨著大量的炎癥反應，諸如白細胞介素-6（IL-6）、NF-κB、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥炎癥因子的激活，降低了腎組織自我修復的能力，最終破壞腎臟結構，導致腎衰竭[11-12]。
JAK/ STAT信號轉導的關鍵生物學功能可分為兩大類：對正常細胞和器官發育必不可少的功能和適應性應激反應激活的功能。然而，持續或失調的JAK/STAT信號轉導，會導致許多疾病，包括以慢性炎癥和纖維化為特征的疾病，以及癌癥。該信號通路控制對細胞穩態至關重要的多個細胞過程，而其中Jak2/Stat3占主導地位，在肝臟以及肺間質疾病中均具有誘發炎癥及纖維化的作用[13-16]。Jak2/Stat3信號通路是一條以磷酸化為主要作用方式的信號通路，是參與炎癥反應的關鍵信號通路。該信號通路以關鍵元件命名，其作用方式通過JAK2磷酸化STAT3，STAT3進一步形成二聚體，轉移進細胞核，參與調控基因的表達。Jak/Stat信號通路可以響應多種細胞因子信號，如白介素、干擾素、促紅細胞生成素等，研究證實該條信號通路同炎癥反應、纖維化進程密切相關[17-19]?，F有研究結果表明；JAK2/STAT3通路在特發性肺纖維化中被激活，并且STAT3能夠參與腫瘤EMT過程以及肝纖維化進程，在多種疾病過程中表現出相同的致纖維化能力[20-22]。在CKD過程中炎癥浸潤是導致RIF的關鍵機制，STAT3作為下游信號分子，在誘導和維持炎癥微環境中起關鍵作用，可以通過crosstalk直接或者誘導NF-κB損傷機制，例如，p65可以與STAT3競爭結合，從而覆蓋相應的結合位點，從而抑制IL-6誘導的γ-纖維蛋白原表達；IL -1可以誘導p65/STAT3蛋白復合物，雖然NF-κB/STAT3之間的直接作用關系目前尚未得到明確的證實，但在UUO模型中是參與炎癥反應的活躍因子，表現出NF-κB、p-STAT3的高表達[23-26]。
研究結果顯示，UUO術后大鼠腎臟出現明顯的損傷，血肌酐、尿素氮、24小時尿蛋白定量數值成倍增長，HE、Masson染色結果同樣證實了RIF的產生，而中藥中劑量、高劑量組對于生化指標的改善整體較為明顯；同時對腎小管擴張、間質炎癥浸潤具有一定的緩解作用。Western Blot檢測中，E-cad、α-SMA是上皮的標志物蛋白，觀察E-cad、α-SMA的前后變化可以評價腎小管細胞EMT的程度。p-Jak2、p-Stat3則是信號通路的關鍵分子，通過檢測磷酸化蛋白同總蛋白的比值的變化，能夠反應出信號通路的激活情況，NF-κB、IκBa是重要的炎癥因子，利用qPCR技術對其定量分析，能夠從一定程度上證明炎癥反應的程度。結果顯示，中劑量和高劑量組能夠下調標志性蛋白E-cad、α-SMA，且對于p-Jak2、p-Stat3、NF-κB、IκBa也同樣具有下調作用。
王耀光教授認為，CKD的病機總體以脾腎虛為本、濕濁瘀血為標，RIF的本質在中醫理論的認識中，屬于腎臟微癥瘕的形成[27-30]。其中濕濁與瘀血貫穿CKD病程始終，是微癥瘕形成的關鍵致病因素。腎臟本身為“先天之本”，能夠藏精泄濁，貯藏精微物質，腎臟貯藏失司造成CKD過程中蛋白尿的產生，腎的疏泄失調則會產生水液的潴留造成CKD的水腫。同時“腎者作強之官，伎巧出焉”，即強于作用、選化形容，其意義在于腎內寄元陽，具有蒸騰陽氣的功能，全身津液的運行依賴于陽氣的蒸化，腎間動氣為三焦之本是經脈生化之源。因此在治療上不應當局限于益腎填精、滋膩厚重之品，應使用溫利之法，溫和通利調節氣化為主。通過健脾益氣的方式“以通為補”，氣壯則濕化、得溫則血行，調節周身氣機的運轉的方式，調動機體的代謝功能。
本研究所使用的加味防己黃芪湯，由《金匱要略》防己黃芪湯化裁而來，原方主治濕病，風濕在表兼氣虛之證，為微汗法代表方，全方意在益氣固表、祛風除濕。加味防己黃芪湯由生黃芪、生白術、防己、赤芍、地龍5味藥組成，去掉原方甘草的甘緩調和之力，生黃芪的用量30 g君藥，配合防己祛風除濕而不傷表；白術生用，健運肺脾升清陽之氣；加赤芍入血分、散惡血、利小便；地龍咸寒下行、搜剔經絡、祛瘀生新，全方扶正祛邪兼顧固表、燥濕、通經、和血四個方面。中醫理論認為“正氣存內則邪不可干”，加味防己黃芪湯治療上采取扶正祛邪的方式，本質上是通過理法方藥的組合，調節機體自身的免疫功能、調動機體的自我修復能力，達到抗炎、抗氧化、免疫調節等目的。相較于單一使用纈沙坦中藥復方效果更具有優勢，原因可能在于中藥具有多靶點的作用方式，現代藥理研究表明[31-34]：白術內酯I以及黃芪甲苷能夠顯著降低phospho-JAK2和phospho-STAT3的蛋白表達水平；黃芪甲苷、芍藥苷，能夠同與JAK2/STAT3通路相關蛋白之間通過分子對接的相互作用，從而減輕炎癥反應以及氧化應激損傷。而應用針對性的藥物赤芍與地龍，則可有目的性的增強對于腎臟微癥瘕的干預作用，藥理研究也表明：赤芍、地龍具有抗炎、抗纖維化、抗氧化等作用[35-37]。結合本研究結果，從一定程度上能夠證實加味防己黃芪湯對于RIF具有改善作用且具有抗炎作用。
綜上，加味防己黃芪湯能夠改善UUO大鼠的血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、減輕UUO大鼠的病理損傷、下調UUO大鼠E-cad、α-SMA、p-Jak2、p-Stat3、NF-κB、IκBa的蛋白表達，從一定程度上能夠證實加味防己黃芪湯能夠干預JAK2/STAT3信號通路起到抗炎、抗纖維化的作用，對于RIF具有延緩作用。
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