抑郁癥在全球范圍內廣泛存在且發病率逐年增加，臨床癥狀主要表現為對各種事物失去興趣、缺乏快樂感、心情抑郁等，同時伴隨入眠困難、缺乏食欲、體質量下降、性欲降低等，被世界衛生組織定義為最易引起患者傷殘的十大疾病之一^[1-2]。抑郁癥具體的發病機制目前尚無明確定義，臨床上認為抑郁癥可能與遺傳、神經內分泌紊亂、神經遞質水平、免疫功能紊亂等多種因素相關^[3-4]。近幾年抑郁癥患者相關數據分析顯示，除遺傳因素外，長期慢性應激也屬于誘發抑郁癥的重要原因^[5]。臨床上治療抑郁癥常用藥物有選擇性5-羥色胺（5-HT）的再攝取抑制劑（氟西汀、舍曲林、帕羅西汀等）、單胺環氧化酶抑制劑、去甲腎上腺素再攝取抑制劑（NE）、三環和四環抗抑郁藥（氯米帕明、米帕明、多賽平等），對于上述藥物治療效果差和嚴重的抑郁癥患者常采用電抽搐治療^[6-7]。西醫治療抑郁癥雖應用廣泛，但其療效有限且伴隨著藥物依賴性和不良反應，在一定程度上限制了抑郁癥患者藥物的使用^[8]。因此，開發抗抑郁效果好且不良反應小的抑郁癥治療藥意義重大。四逆散一方出自張仲景的《傷寒論》，具有調和肝脾、疏肝解郁的作用，被用于肝氣郁結型抑郁癥的治療，大量臨床數據證實四逆散能顯著改善患者抑郁癥癥狀?；诖吮狙芯繑M計劃通過建立大鼠抑郁癥模型，探究四逆散改善大鼠抑郁癥的作用機制，為四逆散臨床廣泛應用提供更多基礎數據。

1 實驗材料 1.1 實驗動物

150只7周齡SPF級SD雄性大鼠，體質量為250~270 g，購買于三峽大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK（鄂）2017-0061。動物實驗遵循減少（Reduction）、優化（Refinement）和替代（Replacement）的3R原則。

1.2 主要儀器試劑

四逆散配伍藥材購自廣州中醫藥大學附屬醫院；鹽酸氟西汀膠囊（國藥準字J20170022）購自禮來蘇州制藥公司；神經肽Y（NPY）、生長抑素（SS）、P物質（SP）放免檢測試劑盒購自北京華英生物技術公司；NE、多巴胺（DA）、5-HT檢測試劑盒購自美國TSZ生物貿易有限公司；細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）抗體、p-ERK1/2抗體、環磷酸腺苷反應結合蛋白（CREB）抗體、p-CREB抗體、腦源性神經營養因子（BDNF）、β-actin抗體均購自英國ABCAM公司。

BW-OF302曠場實驗視頻分析系統購買于上海軟隆科技發展有限公司；MK3全自動酶標儀購自Eppendorf公司；Mini Protean 3 cell電泳儀購自美國BioRed公司。

2 實驗方法 2.1 模型構建

150只大鼠隨機抽取20只為正常組，其余130只根據參考文獻[9]采用慢性溫和不可預知性應激并聯合單籠飼養的方式構建大鼠抑郁癥模型，造模期間大鼠每日選擇以下方式中的1種刺激大鼠：斷食24 h、斷水24 h、4 ℃冰水游泳5 min、夾尾1 min、更換潮濕墊料、50 mV電壓電擊足底、搖晃、晝夜顛倒，且連續兩天刺激方式不得重復，持續處理4周，造模期間正常組自由飲食飲水。造模完成后觀察大鼠狀態，大鼠出現毛色暗沉、自主活動減少、體質量下降，糖水偏嗜降低，呈現出絕望、抑郁癥狀提示大鼠造模成功，造模成功大鼠共100只，模型成功率77%。

2.2 分組給藥

將造模成功的100只大鼠隨機分為模型組、四逆散低劑量組、四逆散中劑量組、四逆散高劑量組及氟西汀陽性對照組，每組20只。參考胡海燕等^[10]給藥劑量配置生藥濃度為1.33、2.66、5.32 g/mL的四逆散藥液，分別灌胃給予四逆散低、中、高劑量組大鼠，氟西汀按0.5 mg/mL灌胃給藥，每日每只灌胃給予2 mL，持續給藥2周，正常組和模型組大鼠每日給予等量的生理鹽水。

2.3 糖水消耗實驗

給藥結束后，各組大鼠禁食禁水24 h，每只動物測試時給予1瓶1%糖水溶液和1瓶純水，大鼠自由飲水12 h后將兩個瓶子取出，稱質量，計算前后大鼠糖水消耗量、純水消耗量、總液體消耗量以及糖水偏愛度。實驗進行過程中保持環境安靜。

糖水消耗量=實驗前糖水重量-實驗結束糖水后糖水重量。

純水消耗量=實驗前純水重量-實驗結束后純水重量。

總液體消耗量=純水消耗量+糖水消耗量。

糖水偏愛度=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

2.4 曠場實驗

給藥結束后，進行曠場實驗，曠場實驗開始之前1 h，將大鼠放置到測試房間內適應1 h。實驗開始后捏住大鼠尾巴小心放入箱體中央，大鼠適應10 s后開始用攝像系統全程記錄大鼠進入箱體內3 min自主活動情況，以大鼠身體超過50%進入其他方格記作水平運動得1分，大鼠雙前肢離開箱子底部記作直立次數得1分，以水平運動得分和直立次數得分總和記作大鼠礦場運動評分，每只鼠測試完成后徹底打掃實驗箱體，去除大鼠排泄物及異味，測試過程中保證測試環境安靜。

2.5 海馬組織神經遞質測定

給藥結束后，首先將大鼠麻醉，腹主動脈取血收集大鼠血液樣本，4 ℃環境下3 500 rpm離心10 min收集大鼠血清后將其置于-80 ℃冰箱保存待測；然后處死大鼠，小心分離大鼠海馬組織，稱質量后按每10 mg組織加90 μL PBS的量加入對應體積的預冷PBS，置于冰上研磨制作組織勻漿，研磨結束后4 ℃條件下3 500 r/min離心10 min，收集上清至干凈微型離心（EP）管中，根據酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒步驟檢測組織勻漿中NE、DA、5-HT含量，神經遞質水平以ng/g腦組織質量表示。

2.6 血清NPY、SP、SS含量測定

取上述凍存各組大鼠血清樣本，然后根據放免試劑盒檢測說明書步驟血清中NPY、SP、SS含量。

2.7 大鼠皮質ERK1/2-CREB-BDNF信號通路檢測

給藥結束后，收集大鼠皮質組織，提取組織蛋白，通過BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度，每組取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離：濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠120 V電泳50 min將蛋白按分子量大小分離；隨后進行濕轉，將蛋白轉移至PVDF膜上；脫脂奶粉封閉2 h；TBST洗膜后，加入ERK1/2、p-ERK、p-CREB、BDNF及β-actin一抗抗體（抗體稀釋比1∶1 000）孵育，4 ℃孵育過夜；洗膜；加入HRP標記的山羊抗兔二抗抗體（1∶5 000）；最后利用ECL化學發光試劑顯色，檢測各個蛋白含量，以β-actin為內參對照。

2.8 統計學處理方法

本實驗中所有實驗數據均利用SPSS 18.0和GraphPadPrism 8軟件進行處理、分析和作圖，數據均以均數±標準差（x±s）表示。多組間兩兩比較采用單因素方差檢驗。P < 0.05表示差異有統計學意義。

3 結果 3.1 大鼠行為學檢測

給藥結束后，各組大鼠進行糖水偏愛度檢測和礦場實驗。實驗結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠糖水偏愛度和曠場運動評分均顯著降低（P < 0.001）；與模型組相比，陽性對照組及四逆散低、中、高劑量組大鼠糖水偏愛度和曠場運動評分均顯著增加（P < 0.001）；與陽性對照組相比，四逆散低、中、高劑量組糖水偏愛度和曠場運動評分較低（P < 0.05），見表 1。

3.2 大鼠海馬組織神經遞質含量測定

給藥結束后，收集大鼠海馬組織，檢測海馬組織中NE、DA和5-HT含量。實驗結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠海馬組織中NE、DA和5-HT均顯著下調（P < 0.001）；與模型組相比，陽性對照組及四逆散低、中、高劑量組大鼠海馬組織中NE、DA和5-HT均顯著上調（P < 0.001）；與陽性對照組相比，四逆散低、中劑量組大鼠NE和5-HT及低、中、高劑量組大鼠DA含量均較低（P < 0.01），高劑量組大鼠海馬組織中NE和5-HT含量較陽性對照組無明顯差異（P > 0.05），見表 2。

3.3 大鼠血清NPY、SP、SS含量測定

給藥結束后，收集大鼠血清樣本，檢測大鼠血清中NPY、SP、SS含量。實驗結果顯示，與正常組相比，模型組組大鼠血清中NPY和SS含量均顯著降低（P均 < 0.001），SP含量顯著增加（P均 < 0.001）；與模型組相比，陽性對照組及四逆散低、中、高劑量組大鼠血清中NPY和SS含量均顯著增加（P均 < 0.001），SP含量均顯著降低（P均 < 0.001）；與陽性對照組相比，四逆散低、中劑量組大鼠血清NPY含量無明顯差異（P > 0.05），高劑量組大鼠血清中NPY含量顯著增加（P < 0.001）；四逆散低、中、高劑量組大鼠血清SP較陽性對照組均顯著升高（P均 < 0.01）；四逆散低劑量組大鼠SS含量較陽性對照組顯著降低（P < 0.001），中、高劑量組大鼠SS含量較陽性對照組無明顯差異（P > 0.05），見表 3。

3.4 大鼠皮質ERK1/2-CREB-BDNF信號通路檢測

實驗結束后，收集大鼠皮質，檢測皮質組織中ERK1/2-CREB-BDNF信號關鍵蛋白表達情況。實驗結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠皮質中p-ERK1/2、p-CREB、BDNF表達量均顯著下調（P < 0.001）；與模型組相比，陽性對照組及四逆散低、中、高劑量組大鼠皮質中p-ERK1/2、p-CREB、BDNF表達量均顯著上調（P < 0.01）；與陽性對照組相比，四逆散低、中劑量組大鼠腦組織中p-ERK1/2及p-CREB表達量較低（P < 0.05），四逆散低劑量組BDNF表達量較低（P < 0.05），四逆散中劑量組BDNF表達量與陽性對照組無顯著差異（P > 0.05）；四逆散高劑量組大鼠腦組織中p-ERK1/2及p-CREB表達量與陽性對照組無顯著性差異（P > 0.05），BDNF表達量顯著高于陽性對照組（P < 0.05），見圖 1，表 4。

4 討論

抑郁癥是目前發病率較高的情感性精神障礙疾病，該病具體發病機制尚不明確，西醫治療效果較為一般，且伴隨較多不良反應^[11]。在傳統中醫理論體系中認為抑郁癥的病因是七情所傷，而肝氣郁結則直接引發抑郁癥，因此疏肝解郁是目前中醫治療抑郁癥的主要出發點^[12]。四逆散由柴胡、芍藥、甘草、枳實4味中藥材配伍組成，其中君藥柴胡入肝、膽經，疏肝解郁、清輕升散，臣藥芍藥養血斂陰以柔肝，佐藥枳實泄熱破結、理氣解郁，使藥甘草益脾和中，四藥相合，共奏疏肝理脾、透邪解郁之效，臨床上被廣泛應用于抑郁癥及肝膽、脾胃失調等多種疾病的治療^[13]。四逆散對抑郁癥的治療雖在臨床上取得較好的效果，但該方具體的作用機制尚未闡明。因此本研究建立大鼠抑郁癥模型，探究四逆散治療抑郁癥作用機制。

抑郁癥患者臨床表現主要包括自主活動減少、情感缺失、體質量下降等，糖水消耗實驗和曠場實驗是用來評價實驗動物抑郁狀態最常用的行為學檢測方法，糖水偏愛度是目前評價大鼠抑郁最重要的公認的指標之一，糖水偏愛度降低顯示大鼠快感反應缺失；曠場運動評分是評價大鼠心理狀態和情緒的經典方法，大鼠活動次數降低，提示大鼠對新環境的好奇度減低^[14-15]。本研究利用糖水消耗實驗和曠場實驗評價給藥后各組大鼠抑郁情況，實驗結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠糖水偏愛度和曠場運動評分均顯著降低，提示大鼠處于抑郁狀態；給予大鼠不同劑量四逆散治療后，其糖水偏愛度和曠場運動評分均顯著增加，且高劑量四逆散治療效果較好，提示大鼠抑郁癥顯著改善。

抑郁癥患者情緒抑郁與神經系統信號轉導異常密切相關，在近幾年的研究中單胺類神經遞質5-HT、DA、NE在抑郁癥中的重要性逐漸顯露^[16]。葛明廣^[17]的研究中發現抑郁癥患者體內5-HT、DA、NE含量顯著降低。李明等^[18]研究也顯示四逆散可顯著提高抑郁癥模型大鼠腦組織中神經遞質5-HT、DA、NE含量，且5-HT、DA、NE含量降低的水平與抑郁癥的程度高度相關。本研究中發現，抑郁癥模型組大鼠海馬組織中5-HT、DA、NE含量均顯著下調，給予不同劑量四逆散治療后大鼠海馬組織中5-HT、DA、NE含量均顯著上調，且四逆散高劑量組對5-HT和NE的上調能力與陽性對照氟西汀的作用無明顯差異，提示高劑量四逆散具有較好的抗抑郁作用，和與上述文獻報道類似。

抑郁癥的發病機制雖尚不明確，但可以確定的是神經肽在該過程中扮演著重要角色，但關于神經肽SS、SP及NPY與抑郁癥相關性的研究不多，NPY是廣泛分布于腦組織中的一種神經多肽，在調節行為應激和情感中發揮重要作用，海馬內NPY能減輕機體對過度應激刺激造成的損傷；SS屬于神經系統內廣泛存在的遞質，可促進5-HT和DA的釋放、活化海馬中突出功能，繼而影響記憶力；SP可與情緒相關的神經遞質通路發生交叉反應，參與人認知和情感的調節^[19]。馮劼等^[20]研究發現四逆散可通過下調血清SS、SP及NPY水平發揮抗抑郁作用。本研究中發現，模型組大鼠血清中NPY和SS含量顯著降低，SP含量顯著增加；給予低、中、高劑量四逆散治療后大鼠血清中NPY、SS含量均呈現不同程度上調，同時SP呈不同程度下調，且高劑量四逆散對NPY的上調作用更加明顯，低、中劑量四逆散對NPY的上調作用及中、高劑量的四逆散對SS的上調作用與陽性藥氟西汀作用無明顯差異，與馮等研究具有一定差異，提示四逆散可能通過調節血清神經肽含量平衡改善抑郁癥，但其對SS、SP及NPY的具體調節作用尚不清楚。

ERK1/2屬于哺乳動物細胞中絲裂原活化蛋白激酶通路中的重要一員，被磷酸化激活后進入細胞核并通過磷酸化作用激活CREB，發揮調節細胞功能的作用，在抑郁癥患者海馬組織和前額葉皮質中可檢測到ERK1/2磷酸化顯著降低^[21]。海馬組織中ERK1/2-CREB信號通路與抑郁癥患者快感缺乏密切相關，也是介導BDNF發揮功能的重要途徑，已有研究報道，提高大鼠腦組織中ERK1/2-CREB-BDNF通路關鍵蛋白表達和磷酸化作用，能顯著改善大鼠抑郁行為^[22]，且Cao等^[23]研究發現四逆散可通過BDNF/PKA/CREB通路改善大鼠抑郁。本研究中發現，四逆散可顯著上調大鼠腦皮質中ERK1/2、CREB磷酸化水平，促進BDNF表達，發揮保護和促進損傷神經元細胞修復作用，改善大鼠抑郁癥癥狀，且高劑量四逆散對BDNF的上調作用較氟西汀明顯。

綜上所述，四逆散可通過上調海馬組織神經遞質NE、DA、5-HT含量；提高血清中神經肽NPY、SS水平，并下調神經肽SP水平；促進ERK1/2-CREB-BDNF通路關鍵蛋白磷酸化，上調通路活性，進而發揮改善大鼠抑郁樣行為的作用。