2023, Vol. 42文章信息
- 李明, 袁金斌, 張遜, 馮昊, 任曉靜
- LI Ming, YUAN Jinbin, ZHANG Xun, FENG Hao, REN Xiaojing
- 基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析吳茱萸的化學成分
- Analysis of chemical constituents from Evodia rutaecarpa by UHPLC-Q-TOF-MS/MS
- 天津中醫藥大學學報, 2023, 42(2): 212-217
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2023, 42(2): 212-217
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2023.02.15
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文章歷史
收稿日期: 2022-08-20
2. 江西中醫藥大學, 南昌 330004;
3. 唐山市協和醫院, 唐山 063000
2. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China;
3. Tangshan Union Hospital, Tangshan 063000, China
吳茱萸是中醫臨床常用藥材，具有溫中、止痛、理氣、燥濕等功效[1]?，F代研究表明，吳茱萸具有鎮痛[2-3]、止嘔[4]、抗炎、抗感染[5]等活性。吳茱萸的化學成分復雜，迄今為止的實驗研究表明，吳茱萸含有多種化學成分，包括生物堿類、黃酮苷類、苯丙素類、檸檬苦素類、有機酸類以及蒽醌類化合物[6]。目前，研究吳茱萸的化學成分主要通過柱色譜分離法，先制備得到單體，然后利用質譜、核磁等波譜技術鑒定其化學結構，這種方法存在諸如分離難度大，研究周期冗長等缺點。近年來，隨著UHPLC-Q-TOF-MS/MS的發展，其在分析鑒定中藥化學成分方面具有高分離效率、高分辨率、高靈敏度等特點[7]，能夠準確提供所測化學成分的分子量，現被廣泛應用于復雜樣品的分析中。本實驗通過UHPLC-Q-TOF-MS/MS測定方法，快速、精準地分析吳茱萸化學成分，為研究吳茱萸毒性成分和藥效成分打下基礎。
1 儀器與材料 1.1 儀器Nexera X2高效液相色譜儀（日本島津公司），配有脫氣器、自動進樣器、柱溫箱、二元泵和檢測器等；質譜儀（ABSCIEX Triple TOF 5600+，AB公司）；電子分析天平（AE-240，北京賽多利斯儀器有限公司）。
1.2 試藥吳茱萸藥材采自江西省新干縣，采收時間為2018年8月中旬，經江西中醫藥大學楊武亮教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.干燥近成熟的果實。
乙腈、甲醇為色譜純（TEDIA）；甲酸、乙醇為分析純（西隴化工）；實驗室自制超純水。
吳茱萸堿（批號：110801200304）、吳茱萸次堿（批號：110802200505）、去氫吳茱萸堿（批號：110800200404）購于中國藥品生物制品檢定所。
2 方法與結果 2.1 供試品溶液的制備選取一定量吳茱萸藥材，經烘干、粉碎、過3號篩后備用，稱取5 g吳茱萸藥材粉末，放置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL 75%乙醇，加熱回流提取2 h，抽濾，保留濾液，殘渣再加50 mL 70%乙醇，加熱回流提取1 h，抽濾后兩次濾液合并，經真空蒸餾后回收至無乙醇氣味，濃縮干燥后得到吳茱萸浸膏，溶于適量甲醇，稀釋至10.0 mL容量瓶中，搖勻，用0.22 μm微孔膜過濾，得供試品溶液。
2.2 混合對照品溶液的制備精密稱取吳茱萸堿0.005 32 g、吳茱萸次堿0.005 81 g和去氫吳茱萸堿0.006 04 g，放置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，用0.22 μm微孔膜過濾，得混合對照品溶液。
2.3 色譜條件ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相為水（0.2%甲酸）-乙腈（0.2%甲酸），流動相洗脫如表 1；流速為0.3 mL/min；溫度30 ℃；進樣量為5 μL。
ESI離子源，正負離子掃描模式，脫溶劑氣體為N2，正離子模式下，毛細管電壓為5 500 V，離子溫度為600 ℃，掃描范圍（m/z）50~2 000 Da；負離子模式下，毛細管電壓為4 500 V，離子溫度為500 ℃，掃描范圍（m/z）100~2 000 Da。
2.5 UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析查閱吳茱萸相關文獻，建立吳茱萸化學成分數據庫，對于混合對照品溶液和供試品溶液的質譜數據，運用PeakView軟件對數據進行分析。使用XIC Manager功能建立吳茱萸已知成分數據庫。通過質譜測定各色譜峰對應的分子式，與已建立的數據庫進行匹配，初步鑒定各成分，最后使用Formula Finder功能結合保留時間、二級碎片、裂解碎片等信息共鑒定出64個化合物的結構?？傠x子流圖見圖 1，具體分析結果見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。
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| 注：A.正離子模式；B.負離子模式。 圖 1 吳茱萸樣品UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析的BPI |
根據質譜中化合物的結構特征和典型的碎片離子，從吳茱萸藥材70%乙醇提取物中鑒定了42個生物堿，主要為吲哚類、喹諾酮類和糖苷類生物堿。
吲哚類生物堿化學式中包含3個氮原子，在質譜碰撞電壓轟擊下容易發生Retro Diels-Alder（RDA）裂解，形成吲哚類生物堿特征離子峰。吳茱萸堿與吳茱萸次堿的裂解方式如圖 2?；衔?0，檢測到該化合物tR=32.62 min，分子式為C19H17N3O，m/z 304.1437 [M+H]+為準分子離子峰。其MS2圖中含有碎片離子171.090 2、161.069 8、144.080 0和134.060 0，碎片離子171.090 2和134.060 0是吳茱萸堿發生RDA裂解產生的特征碎片離子。[M+H-C10H10N]+（m/z 161.069 4）和[M+H-C9H8N2O]+（m/z 144.079 6）則是吳茱萸堿發生RDA裂解后由于分子內雙鍵的重排產生的特征碎片離子，所以推斷為吳茱萸堿。
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| 圖 2 吳茱萸堿（A）和吳茱萸次堿（B）的裂解示意圖 |
化合物44，所測分子式為C18H13N3O，m/z 288.113 6 [M+H]+為其準分子離子峰，比化合物40少16 Da，表明脫去了一個CH4基團。在MS2圖中檢測到273.087 2、244.084 9、169.074 8等碎片離子，273.0872是母離子288.1136脫去一分子CH4產生的，244.084 9和169.074 8是吳茱萸堿經RDA裂解后產生的特征碎片離子。推斷為吳茱萸次堿。
喹諾酮類生物堿母核相同，差異僅在側鏈的碳數及雙鍵位置即側鏈的長度、不飽和度不同。以化合物45為例，測到其化學式為C23H35NO2，其MS2圖中含有碎片離子340.263 6、298.215 6、284.201 7、242.148 6、200.106 7、186.090 6、173.082 8、159.065 7，碎片離子340.263 6是母離子358.274 8脫去一分子H2O產生的。碎片離子159.065 7表明化合物45有N-甲基-4（1H）母核，如圖 3所示。以上碎片信息與喹諾酮類化合物1-Methyl-2-[12-hydroxy-tridecyl]-4（1H）-quinolone碎片信息相符合[10]，因此推斷化合物45為1-甲基-2-[12-羥基-十三烷基]-4（1H）-喹諾酮。
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| 圖 3 1-甲基-2-[12-羥基-十三烷基]-4（1H）-喹諾酮的裂解示意圖 |
糖苷類生物堿以化合物22為例?；衔?2，tR=17.57 min時，正離子模式下準分子離子峰[M+H]+為m/z 612.222 6。該成分在MS2圖中給出了466.163 2和304.108 9的碎片離子，碎片離子466.163 2是母離子612.222 6脫去一個146 Da的鼠李糖Rha（146 Da）產生的碎片離子[M+H-Rha]+，304.108 9為碎片離子612.222 6再丟失1個Glc殘基產生的碎片離子[M+H-Rha-Glc]+得到的，對照參考文獻[11]，推測化合物22為吳茱萸次堿-10-O-蕓香糖苷，其特征裂解方式如圖 4所示。
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| 圖 4 吳茱萸次堿-10-O-蕓香糖苷的裂解示意圖 |
吳茱萸70%醇提物中共鑒定出8個檸檬苦素類化合物，因正負離子模式均有響應，選擇正負離子模式。以化合物31為例，在tR=28.87 min時，分子離子峰m/z 486.188 9[M-H]-，二級碎片給出了423.180 5、397.164 8、365.139 0和259.132 7碎片離子，與文獻[10, 21]報道的吳茱萸苦素質譜數據相同，推斷化合物31為吳茱萸苦素。
2.6.3 黃酮苷類化合物的質譜解析吳茱萸70%醇提物鑒定出8個黃酮苷類化合物，例如化合物12，在tR=11.28 min處檢測到化學式為C15H10O7，m/z 303.050 2[M+H]+為其準分子離子峰。該成分在MS2圖中明顯的碎片離子有m/z 285.040 5、257.043 5和229.048 9。285.0405是母離子m/z 303.050 2脫去一個H2O產生的；257.0435和229.0489分別對應[M+H-H20-CH3-CO]+和[M+H-H2O-CH3-2CO]+碎片離子，這與文獻報道[14]的槲皮素的質譜數據相同。得出該化合物為槲皮素。
2.6.4 苯丙素類化合物的質譜解析化合物2，4，5的保留時間分別為2.19，3.41，3.88，但是其分子式都為C16H18O9，在負離子模式下，準分子離子峰相同，推斷為同分異構體，結合碎片離子191.056 4和161.025 0，191.056 4是經酯鍵水解后產生的奎寧酸負離子，161.025 0是分子失去1個奎寧酸殘基后，再失去1個H2O分子得到的，結合文獻質譜數據[9]，確定化合物2為新綠原酸，化合物4為綠原酸，化合物5為隱綠原酸。
2.6.5 其他化合物的質譜解析除了生物堿，檸檬苦素類，黃酮苷類，苯丙素類成分以外，還鑒定了3個其他類型化合物。如化合物3，在tR=3.15 min處檢測到化學式為C15H18O10，m/z 715.172 2[2M-H]-為其準分子離子峰。該成分在MS2圖中有357.082 0和195.051 5等碎片。[C6H12O7-H]-（m/z 195.051 5）是經酰氧鍵斷裂產生的特征碎片，結合文獻數據[10]，化合物3鑒定為反式咖啡酰葡萄糖酸。
化合物9：tR=5.88 min，化學式為C15H10O5，碎片離子有215.067 7、197.061 4、169.061 4，碎片離子215.067 7是母離子271.060 6脫去一分子H2O和一分子CO產生的，接著丟失1分子H2O得到碎片離子197.061 4，最后脫去一個H2O分子得到碎片離子169.061 4，以上碎片信息與大黃素相符合[13]，因此化合物9被推斷為大黃素。
3 討論為了全面深入地探究吳茱萸的化學成分，本實驗比較了正負模式總離子流圖，結果發現正模式下峰的數量更多，質譜響應更強，但是黃酮苷類、有機酸類和檸檬苦素類在正離子模式下響應偏低，所以本實驗采用了正離子模式與負離子模式對吳茱萸醇提物進行分析。此外，對二級碰撞能量進行了考察，選擇30、35、40 V 3個碰撞能量進行對比，發現35 V下，碎片離子種類豐富且干擾偏少。
本實驗運用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法對吳茱萸醇提取物進行分析，新型的TOF系統特點包括高分離效率、高分辨率、高靈敏度、提供分子量信息等，廣泛應用于各種化合物的分析。本研究共鑒定出64個化合物，包括生物堿類、黃酮苷類、檸檬苦素類、苯丙素類、有機酸類以及蒽醌類化合物，本實驗建立了一種對吳茱萸化學成分快速研究分析的方法，能夠鑒定出更多的化合物，為研究吳茱萸毒性成分和藥效成分打下基礎。
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